尼康显微镜超分辨率显微镜的分子密度

必须以单分子超分辨率成像被认为是关键的方面是每个单独的定位测量的精度，这已被定位于Zui终图像（通常被称为分子密度）探针的密度，和标签本身的物理尺寸。分辨率和单个分子的定位精度之间的关系容易地确定。解决两种荧光分子作为单独的实体的能力是由定位精度，这就决定了每个分子的位置（和不确定性），从而所述一对之间的距离的限制。定位的精度，进而，主要取决于在一个单一的激活失周期从荧光分子收集光子的数目，所提供的背景噪声可以忽略不计。这种互动式的教程探讨分子密度和图像分辨率的概念。

本教程初始化了尼康显微镜一组定位点在窗口稀疏，代表在一个虚拟的样本低程度的分子密度。为了操作的教程，使用局部分子密度滑块增加局部分子的数目，并因此出现在窗口中的图像的分辨率。在Zui高的分子密度，很好的标本细节变得明显。一种新的样品可以使用下拉菜单来选择。 

分子密度和Zui终图像的分辨率之间的关系是在奈奎斯特采样定理，这要求每解析单元大约两个数据点而言Zui好的说明。在将标记效率（在效果的指标分数被标记的）的试样的情况下是不够的，工件如不连续精细结构细节可以出现在超分辨的图像。必要局部荧光探针因此，对于具有尺寸α的空间特征的二维图像时，所需的Zui小的分子密度，以满足奈奎斯特准则是：

Nyquist Molecular Density ≈ (2/α)2(1)

因此，例如，为了实现20纳米的分辨率在两个维度，一是荧光团必须位于至少每10纳米，并且需要为每平方微米约10,000个分子的一个非常高的分子密度。对于超高分辨率的三维空间，20纳米的分辨率要求每立方微米约一百万的荧光。在实践中，低得多的分子密度常常是足够的，当试样的几何形状考虑在内。生物结构往往异构使得即使具有相对高的丰度靶位点的饱和度标记可导致较低的总密度。在一般情况下，荧光探针的足够的密度必须存在，才能充分映射的标记结构的精细的细节。用相同的标准，这些荧光探针的足够数量必须成功地在成像过程中的局部。

在单分子的超分辨技术通过采用光开关的荧光团（例如PALM和STORM）在时间上分离的荧光发射，的开和关的切换动力学的比率是一个重要的实验参数应该是微调的分子密度。在上面描述为每平方微米万的荧光团的分子密度，以实现20纳米的横向平面上的Zui终分辨率的情况下，大约600个​​荧光团必须驻留在点扩散函数的横向投影。这种高分子的密度可以通过一个事实，即大多数光开关荧光团都没有在他们的暗状态，从而导致高背景噪声而变得复杂。这些荧光团或者发出微弱荧光，或者它们可以自发地切换到荧光状态，在完全不存在激活的照明。非特异性的活化可以是自发的或工件可以由成像激光诱导。在情况下，分子的密度非常高，大量的非特异性激活的荧光团可以生成单分子图像重叠，从而影响到实现高精度定位的能力。因此，建议采用了具有低暗态排放，低非特异性激活率光开关的荧光。 

示于图1是涉及影响在单分子超分辨率成像的空间分辨率的Zui关键因素之一，一个重要的概念。该决议与分子密度图1表示为一系列黄色像素的测试图案。可能存在于样本的特征进行成像以逐渐降低的信号 - 噪声比作为分子密度减小（从底部到图1的顶部）（测量像素的分数），这些功能变得不可解析时的平均分子分离方法的特征尺寸（图1中Zui上面一行）。因此，如公式（1）中，为了实现在尺寸n倍更高分辨率D，ND倍的像素必须被获取的。为了不影响任一所述成像速度或信号 - 噪声比，信号采集速率（每秒检测到的光子）来实现这样的分辨率增益必须由至少ND，这需要的因子增加ND倍高暴露于每个图像的激发激光必需的。 

中的时间分辨率来说，单分子基础的超分辨率的方法不直接产生一个图像，而是被用于映射个从数千的个摄像帧确定的特定分子的本地化。在这种情况下，时间分辨率是由所需要获得合适的图像成像的帧的数目来确定。此外，Palm和暴风影音成像用于光开关的荧光基团的性质，可对时间的成像速度的限制。荧光蛋白是优良的，用作在例基因编码的探头，其中定位于特定的亚细胞区室或生物分子的装配是必需的。然而不幸的是，荧光蛋白显示出相对缓慢的光控动力学相比，许多合成的探针，如Cy5标记和Alexa Fluor647，后者可以表现出高开关速度，使1毫秒的摄像周期在大约30纳米，这是一个高分辨率的幅值大于那些荧光蛋白获得的几个数量级。开关周期的速度，以帮助确定单分子超分辨率显微镜的时间分辨率将是在适应这种方法活细胞成像的终极限制。